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技術文章

ELISA技術綜述(二)

點擊次數:328   發布時間:2023/5/15 16:37:18

 
ELISA的商品化試劑盒成分和分類:
 
在臨床檢驗或者科研檢測中,ELISA 實驗通常有商品試劑盒提供。ELISA試劑盒中有三個必要的試劑:免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。
 
完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:(1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);
(2)酶標記的抗原或抗體(結合物);
(3)酶的底物;
(4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中),參考標準品和控制血清(定量測定中);
(5)酶聯物(結合物)及標本的稀釋液;
(6)洗滌液;
(7)酶反應終止液。
 
1、免疫吸附劑
 
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫(2~8℃)干燥的條件下一般可保存6個月以上。有些不完整的試盒,僅供應包被用抗原或抗體,檢測人員需自行包被。如BioTNT 網站中,代理的產品,有的是complete的試劑盒,有的是需要再進行包被的duoset,或者是其他的說法,都是不完整的試劑盒。
 
1.1 固相載體
 
固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器,不參與化學反應?勺鱁LISA中載體的材料很多,常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能,抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性,加之它的價格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料,可制成各種形式。
 
ELISA載體的形狀主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板為常用,用于EILSA的產品稱為ELISA板,上標 準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測,有制成8聯孔條或12聯孔條的,放入座架后,大小與標準ELISA板相同。ELISA板的 特點是可以同時進行大量標本的檢測,并可在特制的比色計上迅速讀出結果,F在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測,包括加樣、洗滌、保 溫、比色等步驟,對操作的標準化為有利。聚苯乙烯經射線照射后,其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加,應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增 多,但用于間接法測抗體時空白值較大。
 
良好的ELISA板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔 之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產品的質量差異很大,因此,每一批號的ELISA板在使用須事先檢查其性能。 常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體,保溫后洗滌, 加底物顯色,終止酶反應后,分別測每孔溶液的吸光度?刂品磻獥l件,使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀數的均數 之差,應小于10%。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯的特點為質軟板薄,可剪割,價廉,但光潔度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。
 
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣,可應用如下的試驗:用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本,將它們進行一系列稀釋后,在 不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定,然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別大,這種載體就是這一ELISA測定項目的 合適的固相載體。
 
在ELISA中,用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸 附面積約為200mm2,小珠均為1000mm2,將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者,球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于佳反應狀態,因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底,使用特殊 的洗滌器,使小珠在洗滌過程中滾動淋洗,其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大,小珠的均一性較差。
 
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面,而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為00-200ul,而小試管可根據需要加大反應體積,標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯,后直接放入分光光度計中比色。
 
也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優點是表面積大,反應在懸液中進行,其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應后用磁鐵的吸引進行分離,洗滌方便,試劑盒一般均配以特殊儀器。
 
應用于科研域,定量檢測的試劑盒,對固相載體的要求比較高,一般采用nunc 或者costar,或者其他知名品牌的酶標板,來進行包被。

原創作者:上海恒遠生物技術發展有限公司

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