主營(yíng)產(chǎn)品:

ELISA試劑盒、人ELISA試劑盒、大鼠ELISA試劑盒、小鼠ELISA試劑盒、生物試劑、抗體、血清、進(jìn)口標準品、微生物培養基
服務(wù)熱線(xiàn):

13636351217

聯(lián)系我們/CONTACT US

聯(lián)系人:錢(qián)經(jīng)理

電 話(huà):13636351217

手 機:13636351217,13636351073

地 址:上海市松江臨港科技城漢橋文化科技園B座

郵 編:201615

傳 真:021-64881400

郵 箱:2881726255@qq.com

阿儀網(wǎng)商鋪:http://www.app17.com/c60514/

手機網(wǎng)站:m.shhyswkj.com

技術(shù)文章

ELISA技術(shù)綜述(三)

點(diǎn)擊次數:14127   發(fā)布時(shí)間:2023/5/22 15:49:56

 
以下簡(jiǎn)述固相載體和包被過(guò)程。
 
1.2 包被的方式
 
將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。換言之,包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過(guò)程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結合 的,靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用力。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對 不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附 力,其聯(lián)結多發(fā)生在Fc段上,抗體結合點(diǎn)暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在 于或鄰近于疏水區域時(shí),抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露,在這種情況下,直接包被效果不佳,可以采用間接的捕獲包被法,即先將針對該 抗原的特異抗體作預包被,其后通過(guò)抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面,其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相 抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大提高,因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗的特異性、敏感性均由此得以改善,重復性亦佳。間接 包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少,僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如,在檢測抗 DNA抗體時(shí),需用DNA作為包被抗原,而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合?蓪⒕郾揭蚁┌逑冉(jīng)紫外線(xiàn)照射(例如30W紫外燈,75cm照射12小 時(shí)),以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì),如聚賴(lài)氨酸、魚(yú)精蛋白等作預包被,也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被,即用親和素先包被載體,然后加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固,已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
 
 
脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結合,可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
 
 
 
1.3 包被用抗原
 
用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物 培養物等,須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取,一般的細菌和病毒抗原可以從其培養物中提取,蛋白成份抗原可從富含此抗原的 材料中提取等(例如AFP從臍帶血或胎肝中提。。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達的蛋白質(zhì)抗原,多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工 程菌成份外,其他雜質(zhì)少,而且無(wú)傳染性,但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份,用于ELISA,在反應中可出現假 陽(yáng)性,因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝 炎病毒(HCV)尚不能培養成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量微。目檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據HCV的基因克隆表達而 制備的重組抗原。在傳染病診斷中,不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據蛋白質(zhì)抗原分子的某 一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇,純度高,特異性也高,但由于分子量太小,往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)(BSA)等偶聯(lián),借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附,間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一 注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇,因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應。 另外,某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結構變化,在這種情況下,用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。
 
 
1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性,可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)(即便是微量的),在抗血清中將 出現雜抗體,必須除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保證試驗的特異性?寡宀荒苤苯佑糜诎,應先提取IgG,通常采用硫酸銨鹽析和 Sephadex凝膠過(guò)濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被,高度純化的IgG性質(zhì)不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性,則 可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高,特異性亦較強,因此不需要作吸收和親和層析處理,一般可將腹水作適當稀 釋后直接包被,必要時(shí)也可用純化的IgG。應用單抗包被時(shí)應注意,一種單抗僅針對一種抗原決定簇,在某些情況下,用多種單抗混合包被,可取得更好的效果。
 
 
1.5  包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時(shí)間,包被液的pH等應根據試驗的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作 為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放 置過(guò)夜,37℃中保溫2小時(shí)被認為具有同等的包被效果。包被的適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過(guò)實(shí)驗與酶結合物的濃度協(xié)調選 定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
 
 
1.6 封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú) 關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙,封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,從而排 斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續與包被相類(lèi)似。常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或 1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,其大的特點(diǎn)是價(jià)廉,可以高濃度使用(5%)。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用, 但由于奶粉的成份復雜,而且封閉后的載體不易長(cháng)期保存,因此在試劑盒的制備中較少應用。
 
 
封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗條 件。并非所有的ELISA固相均需封閉,封閉不當反而會(huì )使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái),雙抗體夾心法,只要酶標記物是高活性的,操作時(shí)洗滌徹底,不經(jīng)封閉也可 得到滿(mǎn)意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí),因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面,業(yè)已起到了類(lèi)似封閉劑的作用。但在間接法測定中,封閉 一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保存數月。

原創(chuàng )作者:上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司

首 頁(yè)| 公司介紹| 產(chǎn)品展示| 公司新聞| 技術(shù)文章| 聯(lián)系我們| 客戶(hù)留言

阿儀網(wǎng) 設計制作,未經(jīng)允許翻錄必究. 聯(lián)系人:錢(qián)經(jīng)理 聯(lián)系電話(huà):13636351217 ICP備案號:滬ICP備11004148號-11 總訪(fǎng)問(wèn)量:8490202 管理登錄

主營(yíng)產(chǎn)品:ELISA試劑盒、人ELISA試劑盒、大鼠ELISA試劑盒、小鼠ELISA試劑盒、生物試劑、抗體、血清、進(jìn)口標準品、微生物培養基

掃一掃,關(guān)注我們!

国产午夜免费啪视频观看视频_被黑人猛躁10次高潮视频_精品日本免费一区二区三区_国产黄A三级三级三级